當前觀點：【賽思基因】熒光素酶生物檢測技術的應用

賽思基因（www.scientsgene.com），專注遺傳轉化技術的應用于開發，致力于打破基因型限制，助力基因編輯育種。

介紹一個常用的實驗技術~

(相關資料圖)

利用熒光素酶與底物結合發生化學發光反應的特點，把感興趣的基因轉錄的調控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（firefly luciferase）的上游，構建成熒光素酶報告質粒。然后轉化煙草，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷性刺前后或不同刺激對感興趣的調控元件的影響。為了減少內在的變化因素對實驗準確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinilla luciferase)的質粒作為對照質粒與報告基因質粒共轉化，提供轉錄活力的內對照，使測試結果不受實驗條件變化的干擾。

技術背景

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熒光素酶生物檢測技術誕生于1990年，已有30年的發展史。單熒光素酶檢測系統到雙熒光素酶檢測系統的發展，為科研人員提供了更為嚴謹的實驗手段。雙熒光素酶報告基因檢測系統在原有的基礎上引入了海腎報告基因，可以排除不同組之間細胞生長狀況、細胞數目以及轉染效率帶來的干擾，起到校正的作用，從而使實驗結果更為可靠。

什么是雙熒光素酶？

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雙熒光素酶通常是指螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素。其中熒火蟲熒光素是從螢火蟲中分離得到，分子量為61 kDa；而海腎（Renilla）熒光素酶則是從海腎（Renilla reniformis）中分離，分子量為36 kDa。

兩種熒光素酶的區別是什么？

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①底物和輔因子不同：螢火蟲熒光素酶需要熒光素、氧氣、ATP和鎂離子同時存在才能發光；而海腎熒光素酶僅需要腔腸素（coelenterazine）和氧氣。

②發光的顏色不同：螢火蟲熒光素酶產生的光顏色呈現黃綠色，波長550-570nm；而海腎熒光素酶產生藍光，波長480nm。正是由于這兩種酶的底物和發光顏色不同，所以在雙熒光素酶報告實驗中得到廣泛應用，它們的發光原理如下所示：

實驗原理

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Firefly luciferase和Renilla luciferase之所以被稱為報告基因，是因為在基因表達調控研究時，利用兩者表達產生的熒光比值可以監控、證實微觀層面上的分子間的相互作用。具體做法是：將靶基因的轉錄調控元件或5’啟動子區克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR區或lncRNA結合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游，以研究啟動子的強弱和轉錄因子對啟動子的作用或miRNA對目的基因或lncRNA的調控作用（見圖2）。與此同時，引入包含Renilla luciferase基因的TK載體作為內參，以便消除細胞轉染等因素帶來的組間誤差。

Dual Luciferase Reporter實驗步驟

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以煙草為材料進行Dual Luciferase Reporter的實驗步驟：

1）構建相應的載體。

2）挑取轉化有重組質粒的農桿菌單菌落，接種到2 mL LB液體培養基（添加相應抗生素）中，28℃ 220 rpm培養過夜。

3）農桿菌培養至OD600為1.0，1700× g離心5 min收集菌體后，用1/2MS液體培養基清洗菌體2次；用含有150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液體培養基將農桿菌的OD600調至1.0。

4）將待檢測的農桿菌菌液進行混合，使每種菌液的OD600為0.5。

5）選取生長期為1個月左右完全伸展的煙草葉片，將混合好的菌液用1 mL注射器(去掉針頭)從煙草葉背面進行注射。為保證實驗結果的一致性，需要將對照載體和待檢測目標載體的菌液注射在同一葉片的不同部位上, 以保證相同的生長背景。

6）正常溫室生長條件下，24-48 h即可取樣觀察。

7）取3-4片直徑為6-8 mm的葉盤，放入2 mL的EP管（提前放入3-4個小鋼珠）中，液氮中冷凍，使用破碎儀進行研磨破碎（45 Hz，30 s）。破碎完全后在EP管中加入100 μL裂解液。

8）冰上孵育5 min左右，充分裂解葉片。

9）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。

10）熒光檢測：

①取20 μL裂解液，加至培養板中。按照實驗需要，可設置3孔-5孔重復。

②配制螢火蟲螢光素酶反應工作液和海腎螢光素酶反應液，即螢火蟲螢光素酶底物（50 ×）和海腎螢光素酶底物（50×）。

分別用對應的緩沖液稀釋至1×工作液。并孵育至室溫。

③加入100 μL螢火蟲螢光素酶反應液，震板混勻，檢測螢火蟲螢光素酶的活力，檢測盡量在30 min內完成。

④加入100 μL海腎螢光素酶反應液，震板混勻，檢測海腎螢光素酶的活力，檢測盡量在30 min內完成。

熒光素酶報告基因的特點

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1、優越的靈敏度，比Western bloting靈敏度高1000倍以上；

2、內源性低，無內源性表達；

3、熒光素酶檢測不受細胞內其他物質影響；

4、發光檢測，檢測方便；

5、靈敏度高，1020摩爾熒光素酶分子；

6、檢測范圍廣，大于7個數量級。

主要應用領域

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1、潛在啟動子/啟動子核心區域檢測；

2、潛在增強子/抑制子等調控子核心元件檢測；

3、啟動子區可能的轉錄因子結合位點檢測；

4、啟動子/增強子與轉錄因子的相互作用；

5、病毒/細胞相互作用；

6、物理化學等誘導因素對啟動子活性的調節（抑制或增強）；

參考文獻

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