環球快看點丨PMA的應用是什么？基于PMA-qPCR的生物學檢測方法

基于核酸的分子生物學檢測方法，如聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR），能夠用于精準地分析樣本中微生物的種類和豐度，但是難以區分微生物的存活狀態。傳統的用于檢測樣本中活細胞的方法都需要對樣本進行培養，但是此類檢測方法存在一定的局限性，無法用于檢測一些難培養或是不可培養的活細胞。疊氮溴化丙錠（Propidium monoazide，PMA）是一種能與DNA結合的光反應染料，不具有細胞膜滲透性，無法穿透活細胞完整的細胞膜，只能選擇性地穿透死細胞受損的細胞膜。進入細胞后，PMA會與DNA雙螺旋發生共價交聯，進而阻礙死細胞中目標DNA的PCR擴增，如圖1所示?；赑MA的這一特性，通過對PMA處理過的樣本進行PCR擴增和測序分析，即可得知樣本中微生物的存活狀態。

現在已經有越來越多的文獻報道采用了PMA-PCR或PMA-qPCR等方法對樣本中的活細胞進行定性或定量分析，下面解讀三篇文獻。

(相關資料圖)

文獻一：Andreas N, Katherine ES, Anne KC. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods, 2007, Volume 70, Issue 2.

文章采用了PMA-qPCR的方法，對四種常用的滅菌方法進行了效率評估。作者選擇了鼠傷寒沙門氏桿菌、單核細胞增生李斯特菌、大腸桿菌和鳥分枝桿菌這四種常見的致病菌，分別采用次氯酸鹽、苯扎氯銨、紫外線和加熱消毒法進行滅菌處理，并用PMA進行交聯處理。將處理好的樣本和未經處理的對照樣本一起進行基因組抽提，并分別用四株菌的特異引物對樣本進行qPCR定量分析。作者還同時對樣本進行了平板培養，作為PMA處理效果的對照實驗。

根據實驗結果，次氯酸鹽、苯扎氯銨和加熱消毒法的滅菌效果都符合預期，PMA-qPCR和平板培養的結果基本一致，部分結果如下圖1所示。而紫外線處理的樣本經過PMA處理后，qPCR定量結果與未處理對照組的基本一致，如下圖2所示，且PMA-qPCR的結果與平板培養的結果之間存在較大的差異，其原因可能是紫外線的滅菌原理是破壞微生物的DNA而非細胞膜，這導致了PMA無法與死細胞的DNA進行共價交聯，只有用紫外線進行長時間的照射處理才能破壞細胞膜。

圖1不同濃度的次氯酸鹽對沙門氏菌的滅菌效果。（A）平板計數的結果，橫坐標表示次氯酸鹽濃度，C為未處理對照。（B）PMA處理后將菌體轉移至裂解抽提管中。（C）PMA處理（+）和未處理對照組（-）基因組的凝膠電泳圖。（D）qPCR定量結果，縱坐標為未處理對照組和PMA處理組的Ct值差。

圖2.不同時長的紫外線處理對大腸桿菌的滅菌效果。（A）PMA處理和未處理對照組的qPCR定量結果，橫坐標代表紫外線處理時長，縱坐標為Ct值。（B）PMA處理（+）和未處理對照組（-）基因組的凝膠電泳圖。

文獻二：Jialing N, Shingo H, Yin W, et al. Uncovering Viable Microbiome in Anaerobic Sludge Digesters by Propidium Monoazide (PMA)-PCR. Microbial Ecology, 2019, Volume 79.

厭氧消化是一種非常高效的污水處理方法，若想維持厭氧消化池的正常運作，就必須首先了解參與消化的微生物種群。本文的作者從多個污水廠采集了污泥樣本，分別做了PMA處理和不處理的對照，并進行基因組抽提、16S V3-V4高通量測序和qPCR定量分析。

根據qPCR定量的結果，發現用PMA處理過的樣本中16S拷貝數少于未處理過的樣本，說明在樣本中約有10%的死細胞。對高通量結果進行分析，發現用PMA處理過的樣本中微生物的種類和多樣性要明顯少于未處理過的對照樣本，如下圖1所示，部分細菌在經過PMA處理后相對豐度降低了約90%，如α-變形菌和β-變形菌，這些微生物可以被視為污水處理過程中的殘留物；而有些細菌的相對豐度則升高了，如擬桿菌門、綠彎菌門和厚壁菌門的微生物，具體可見下圖2。在所有用PMA處理過的樣本中，廣古菌門、擬桿菌門、δ-變形菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、WWE1、螺旋體門、互養菌門和Caldiserica門的微生物占了大多數。

文獻三：Lanxin M, Jie Y, Hao J, et al. Investigating the bacterial microbiota of traditional fermented dairy products using propidium monoazide with single-molecule real-time sequencing. Journal of Dairy Science, 2019, Volume 102, Issue 5.

乳制品在游牧民族中是一類頗受歡迎的食品，而發酵類乳制品中的微生物，尤其是乳酸菌，能夠提高乳制品的外觀和口感。過去對于乳制品中微生物的鑒定往往采用培養法，但是此方法不僅費時費力，對于一些苛養菌（fastidious microbes）的檢測效果也不是很理想。本文的作者對多種傳統發酵乳制品進行了采樣，使用PMA與三代測序結合的方法，對樣本中的活菌和死菌分別進行了分析。作者同時還采用了傳統的培養法對樣本中的微生物進行分離和鑒定。

分析測序結果，發現乳酸桿菌的相對豐度在所有樣本中都是最高的。部分樣本在經過PMA處理后，乳酸桿菌的相對豐度都有所提高，鏈球菌的相對豐度則有所下降；另外一些樣本中則是腸桿菌的相對豐度提高了，而乳酸桿菌的相對豐度發生了下降，具體可參考下圖1。對比PMA處理的結果和傳統培養法的結果，作者發現使用PMA處理的方法可以檢測到一些使用培養法檢測不到的痕量微生物，如清酒乳桿菌和腸膜明串珠菌。

微基生物現在也開發出了一套對樣本進行PMA處理和高通量/qPCR定量分析的系統，能夠對樣本中的活菌進行較為精準地定性和定量分析。